Nuove conoscenze sull’aroma dell’olio

Oltre ad essere un alimento di grande pregio nutrizionale, di primaria importanza nella “dieta mediterranea”, l’olio extra vergine di oliva (Oevo) è un alimento dotato di una ricca carica sensoriale che lo rende unico tra gli oli vegetali. Il primo impatto del nostro organismo con un alimento è legato, infatti, alle sue caratteristiche organolettiche: colore e note olfatto-gustative (flavour).

Nel caso specifico dell’olio extra vergine di oliva l’esame organolettico assume un ruolo fondamentale anche nella definizione della qualità legale dell’olio commercializzabile. Infatti, la normativa dell’Unione Europea (Reg. Cee 2568/91 e successivi aggiornamenti, incluso il Reg. Ue 299/2013) prevede che un olio di oliva, per essere commercializzato con la definizione di “extra vergine”, deve presentare, oltre ai valori degli indici analitici (acidità, numero di perossidi, indici di assorbimento all’UV ed etil-esteri) nei limiti prefissati, l’assenza di qualsiasi difetto organolettico valutato secondo il metodo del Panel test dell’Iooc (International Olive Oil Council).

Le diverse sfumature del flavour degli oli extra vergini di oliva sono legate al livello e alla composizione della frazione volatile e polifenolica, a loro volta influenzate da numerosi parametri agronomici e tecnologici (Angerosa, 2002; Aparicio e Luna, 2002; Angerosa et al., 2004; Sacchi et al., 2010).

La componente fenolica conferisce all’olio extra vergine di oliva le caratteristiche sensoriali positive di amaro, piccante e astringente. Ovviamente, l’intensità di questi descrittori dipende da molti fattori, tra i quali lo stato di maturazione delle olive. Infatti, è stato dimostrato che la percezione dell’amaro e del piccante è maggiore se l’olio è ottenuto da un frutto acerbo rispetto a uno in stato di maturazione più avanzato (Morales et al., 2000 Bendini et al., 2007).

Odore e aroma

In base al percorso che le molecole volatili compiono per raggiungere l’epitelio olfattivo, è possibile distinguere due caratteri sensoriali legati all’odorato: l’odore e l’aroma. La differenza tra i due termini è estremamente precisa:

• odore, quando le molecole odorose raggiungono l’epitelio olfattivo passando attraverso le narici, cioè seguono la via nasale diretta (ortonasale);
• aroma, invece, quando seguono la via retronasale (figura in apertura).

Le sensazioni ortonasale e retronasale si differenziano per il livello di percezione, anche se coinvolgono i medesimi meccanismi (Burdach et al., 1984).

La degustazione in bocca può significativamente aumentare o diminuire l’intensità della percezione degli stessi composti rispetto a come sono percepiti per via ortonasale. L’olio nella cavità orale, infatti, è diluito con la saliva, è riscaldato a 37°C (temperatura corporea) e i composti responsabili del flavour vengono percepiti attraverso una serie di eventi che prevedono il rilascio ed il trasferimento ai recettori sensoriali. In questa fase, le molecole che stimolano tali recettori devono trovarsi disciolte in fase acquosa per raggiungere le cellule recettrici del gusto. Simultaneamente, attraverso il respiro, si ha il trasferimento in fase vapore delle molecole aromatiche ai recettori olfattivi. La liberazione dei componenti volatili dall’alimento è influenzata dal suo stato fisico, dalla masticazione e dalla saliva. Una serie di effetti di ripartizione, tra loro correlati, determinano la concentrazione dei componenti aromatici nelle differenti fasi generatisi nella bocca durante il consumo dell’alimento. Per i componenti volatili, questi processi possono essere sintetizzati in termini di:

1. rilascio iniziale in bocca dall’alimento alla fase saliva;
2. passaggio dalla saliva/alimento alla fase aria;
3. diluizione e trasporto dalla fase aria nella bocca alle vie aeree del naso.

La percezione dei gusti

La sensazione gustativa di amaro è percepita nella parte posteriore e laterale della lingua grazie alle interazioni che vengono a crearsi tra le molecole polari (polifenoli) e le papille gustative presenti sulla lingua (Angerosa et al., 2004). La sensazione piccante o pungente è una sorta di percezione di bruciore, in questo caso, non generato dalle alte temperature, ma dovuto alla stimolazione tattile dei recettori del calore presenti all’interno della cavità orale, in particolare sulle mucose. Infine, la sensazione di astringenza, sensazione di secchezza, rugosità e allappamento, può essere percepita non solo sulla lingua ma in tutta la cavità orale grazie all’interazione dei fenoli con le proteine ricche di prolina presenti nella saliva. Diversi studi hanno dimostrato che nell’olio i maggiori responsabili degli attributi amaro e piccante sono i biofenoli ed in particolare gli agliconi dei secoiridoidi (Tovar et al., 2001; Andrewes et al., 2003).

I composti volatili, invece, sono responsabili dell’odore e dell’aroma dell’olio extra vergine di oliva (Angerosa et al., 2004). Complessivamente, nell’olio extra vergine di oliva sono stati identificati circa 180 composti volatili appartenenti alle classi chimiche delle aldeidi, alcoli, esteri, idrocarburi, chetoni, furani e terpeni. Tra questi conferiscono all’olio il maggior impatto sensoriale quelli a 5 o 6 atomi di carbonio, generati durante un processo enzimatico molto complesso che prende il nome di “cascata della lipossigenasi” (Olias et al., 1993) (figura 2).

Queste reazioni enzimatiche avvengono a carico dell’acido linoleico e linolenico e sono dovute alla presenza di enzimi quali le lipossigenasi (LOX), presenti naturalmente nell’oliva, che iniziano ad agire durante le prime operazioni di frangitura. La LOX è un enzima non-eme contenente ferro, che ha la funzione di catalizzare le ossidazioni della sequenza 1,4-pentadiene degli acidi grassi polinsaturi per produrre i corrispettivi idroperossidi. Dall’azione sequenziale delle lipasi e delle lipossigenasi e insieme all’azione combinata dell’idroperossidoliasi, a partire dagli acidi grassi polinsaturi otteniamo la formazione di composti aldeidici a sei atomi e a nove atomi di carbonio. Successivamente otteniamo per riduzione delle aldeidi, attraverso l’enzima alcool-deidrogenasi, i rispettivi alcoli, dai quali a loro volta si possono formare i rispettivi esteri ad opera della alcol acetil transferasi. Gli acidi grassi maggiormente coinvolti nella cascata della lipossigenasi sono l’acido linoleico (LA) e l’acido linolenico (LnA), prodotti dalla scissione dei trigliceridi o lipidi polari di membrana ad opera dell’enzima lipasi o acilidrolasi. Le LOX portano alla formazione, in maniera preferenziale, degli idroperossidi in posizione 13, la cui decomposizione, catalizzata dalla idroperossidoliasi, determina la formazione di aldeidi a sei atomi di carbonio, tra cui l’esanale (note verdi) e la cis-3-esenale (note di foglia di pomodoro). Successivamente la cis-3-esenale isomerizza rapidamente dando origine alla trans-2-esenale (note di erba, mandorla), che solitamente rappresenta il composto volatile più abbondante dell’olio extra vergine di oliva di buona qualità, conferendo all’olio un aroma erbaceo e gradevole. Le alcol-deidrogenasi (ADH), successivamente, hanno la funzione di trasformare le aldeidi nei corrispettivi alcoli rendendo le note erbacee meno aggressive. La successiva esterificazione, ad opera dell’alcol-acetil-transferasi (AAT), determina la produzione di esteri con un impatto dolce, tipico della frutta matura (Angerosa et al., 2004).

Un percorso addizionale alla via della lipossigenasi è attivato quando il substrato è l’acido linolenico. La LOX potrebbe catalizzare, oltre alla formazione degli idroperossidi, anche la loro scissione attraverso una donazione di un gruppo alcossi radicale per la stabilizzazione del radicale 1,3-pentene. Questi ultimi composti possono dimerizzare portando alla formazione di idrocarburi a dieci atomi di carbonio (C10), conosciuti come penteni dimeri, o possono unirsi con idrossi radicale presente nel mezzo, producendo alcoli a cinque atomi di carbonio, che possono essere successivamente ossidati enzimaticamente ai corrispondenti composti carbonilici a cinque atomi di carbonio (Angerosa et al., 2004).

Parallelamente alla cascata delle lipossigenasi, possibili fermentazioni degli zuccheri o metabolismo di alcuni amminoacidi (leucina, isoleucina e valina) o attività enzimatica o processi ossidativi portano alla formazione di altri composti volatili che vanno così ad aumentare la complessità olfattiva dell’olio. Queste reazioni, però, possono portare alla comparsa di difetti (off-flavour).

Gli off-flavour dell’olio vergine di oliva

L’insorgenza dei difetti organolettici dipende da svariati fattori:

• sanità e maturazione delle olive,
• modalità di raccolta e post-raccolta,
• condizioni di stoccaggio,
• tecnologia utilizzata per l’estrazione,
• conservazione,
• travasi e filtrazione del prodotto.

Ogni fase del processo produttivo può influenzare, infatti, la composizione delle sostanze volatili e la comparsa di off-flavour. I difetti organolettici si possono classificare con particolari denominazioni che ne descrivono il caratteristico aroma.

Muffa-umidità

Il difetto di muffa-umidità è l’aroma caratteristico di oli provenienti da olive nelle quali si sono sviluppati funghi e muffe, causati da un lungo periodo di permanenza in ambienti umidi e mal areati. Le specie più presenti sono Penicillum e Aspergillus che ossidano gli acidi grassi liberi, con formazione di metilchetoni come il 2-eptanone e 2-nonanone. I lieviti, come Candida e Saccharomyces, parallelamente, riescono a ridurre i gruppi carbonilici grazie a esterificazione, contribuendo alla produzione di un olio con difetto di muffa-umido. Le molecole volatili che maggiormente contribuiscono a tale difetto sono 1-otten-3-one, 1-otten-3-olo, 3-metilbuta- nolo e 6-metil-5-epten-2-one.

Avvinato-inacetito

L’avvinato-inacetito è il difetto tipico di oli ottenuti da olive non fresche che hanno subito la fermentazione alcolica e acetica. I principali batteri coinvolti in questo processo sono quelli lattici (Lactobacillus) e quelli acetici, i quali producono, in assenza di ossigeno, prima etanolo e poi acido acetico e acetato di etile, composti volatili che sono i maggiori responsabili di questo difetto (Morales et al., 2005).

Riscaldo e morchia

Il riscaldo è l’aroma formatosi in olive conservate a lungo in strati di elevato spessore o in sacchi, che hanno subito diverse fermentazioni tra cui quella principale è la lattica; mentre la morchia è l’aroma caratteristico di oli rimasti per lungo tempo a contatto con i propri fondami che hanno subito una fermentazione anaerobica principalmente butirrica. I principali microrganismi individuati in un olio affetto da riscaldo, fanno parte della famiglia delle Enterobacteriaceae, la cui proliferazione parte all’inizio della fase di stoccaggio, e Pseudomonas, Clostridium e Serratia, la cui crescita è più tardiva. È stata notata la presenza di metil-butanoato, mentre le concentrazioni di etil-propanoato e butil-acetato sono più alte rispetto a un olio senza difetto. L’alta concentrazione di 6-metil-5-penten-2-one può essere spiegata dalla presenza degli Pseudomonas che degradano gli alcoli terpenici. Invece, l’abbondanza di acidi butanoico e propanoico è dovuta al metabolismo dei Clostridium e dei batteri propionici.

Rancido

Il rancido è un off-flavour derivante dall’ossidazione dell’olio, fenomeno favorito dal prolungato contatto con l’aria, l’esposizione alla luce e a temperature relativamente alte. I principali composti presenti in un olio rancido sono le aldeidi (2-ottanale, 2-eptenale, 2-decenale, esanale, nonanale, ottanale, pentanale, eptanale) generate durante l’ossidazione degli acidi grassi. Quando si ritrovano anche acidi (come il butanoico, esanoico, eptanoico), significa che il processo di ossidazione è molto spinto, in quanto gli acidi si generano dall’ossidazione delle aldeidi (Morales et al., 2005).

L’unico metodo oggi previsto dalla normativa comunitaria per l’accettazione dei requisiti organolettici, è l’analisi sensoriale condotta secondo il metodo del Panel test Iooc (Reg. Cee 2568/91 e successivi aggiornamenti tra cui Reg. Ue 299/2013). L’attribuzione anche di una sola nota negativa dagli assaggiatori accreditati ne sancisce il declassamento, ad esempio dalla categoria extra vergine a quella inferiore di vergine.

Impatto odoroso delle molecole volatili

La presenza di una molecola volatile a elevati livelli di concentrazione non è condizione sufficiente per essere percepita in fase di assaggio. Infatti, esistono delle molecole che, pur essendo presenti in minori quantità, vengono percepite di più rispetto ad altre che presentano una concentrazione maggiore. Un esempio può essere quello dell’1-penten-3-one che è presente in pochi μg/kg, ma il suo impatto olfattivo è tre volte più intenso del trans-2-esenale, ritrovato in concentrazioni dell’ordine di decine di mg/kg (Reiners e Grosch, 1998). Ogni molecola volatile ha infatti una diversa soglia di percezione, ovvero la concentrazione limite al di sotto della quale non viene rilevata dal nostro naso.

Il calcolo del valore dell’attività odorosa (Odour Activity Value), ovvero del rapporto tra la concentrazione e la soglia di percezione, permette di stimare il reale contributo di ogni molecola all’aroma globale. Questa strategia analitica, in alcuni casi, ha permesso di identificare i composti chiave dell’aroma dell’olio, come il 4-metossi-2-metil-2-butanetiolo, considerato specifico del tipico aroma dell’olio ottenuto da varietà spagnole (Reiners e Grosch, 1998). In altri casi ha permesso di stimare il contributo di ogni singola molecola agli off-flavour stabilendo, ad esempio, che 1-otten-3-olo è il principale marcatore del difetto muffa-umidità, butanoato di etile, acido propanoico e butanoico del difetto di riscaldo, acido acetico, 3-metil-1-butanolo ed acetato di etile del difetto di avvinato-inacetito (Morales et al., 2005).

Di recente applicazione è anche il raggruppamento degli Oav di composti volatili con descrittori simili in serie aromatiche per ottenere, da dati analitici, utili informazioni sui descrittori sensoriali dell’olio vergine di oliva (Genovese et al., 2014) (figura 3).

In tal modo è possibile spiegare analiticamente le varie sfumature di odore percepite in diversi Oevo. Cinquanta composti volatili potenzialmente odorosi sono stati quantificati, mediante la tecnica SPME-GC/MS, in venticinque campioni di olio ottenuti da quattro cultivar di olivo italiane e quattro spagnole. Calcolato l’Oav di ciascun composto volatile, questi sono stati raggruppati in base ai descrittori sensoriali simili e sono state definite così dodici serie aromatiche: erbaceo, foglia, fruttato, pungente, mandorla amara, mela, pomodoro, dolce, legnoso-speziato, floreale, grasso e fungo. L’analisi statistica multivariata (PCA) delle dodici serie aromatiche ha mostrato una chiara differenziazione degli Oevo italiani da quelli spagnoli. Le principali serie aromatiche che caratterizzano gli Oevo italiani sono risultate essere erbaceo, pungente, amaro, mela e floreale, mentre quelli spagnoli sono risultati essere caratterizzati dalla serie fruttato (grafico 1).

Inoltre, riportando i valori delle serie aromatiche per ciascun Oevo in un grafico realizzato come un “codice a barre” è stato possibile creare una rappresentazione grafica comprensibile ed efficace, che permette facilmente di descrivere l’identità aromatica di ciascun olio (grafico 2). Questa rappresentazione visiva potrebbe rendere l’applicazione delle serie aromatiche un utile strumento, non solo nel controllo della qualità dell’Oevo, ma anche nel comunicare queste informazioni sensoriali al consumatore.

Influenza della saliva sul rilascio d’aroma

La natura e l’intensità dello stimolo aromatico, come anche di quello gustativo, dipendono non solo dalla presenza e dalla concentrazione dello stimulus nel cavo orale e nel tratto nasofaringeo, ma anche da tutti i processi orali che ne vanno a modificare il suo rilascio e trasferimento. Questi includono la struttura e la composizione dell’alimento, la natura chimica e le proprietà chimico-fisiche degli stimoli e differenti fattori fisiologici come la temperatura ed il pH della bocca, la saliva, il flusso di saliva, la masticazione, la velocità a cui l’alimento è miscelato durante la masticazione e le dimensioni del bolo (Piggott e Schaschke, 2001). Inoltre, la respirazione e la diluizione con la saliva provocano un continuo cambiamento in termini di volume, composizione e viscosità dell’alimento una volta introdotto nel cavo orale. Tra i fattori fisiologici, la saliva gioca un ruolo importante nella percezione dell’aroma retronasale di un alimento (Ployon et al., 2017). La velocità di flusso e la composizione della saliva varia mediamente tra soggetti e per ogni singolo soggetto può variare nell’arco di una giornata (Chen, 2009).

La saliva è un fluido ipotonico e contiene circa il 98% di acqua e il 2% di sostanze organiche e inorganiche disciolte in essa come elettroliti, muco, glicoproteine, proteine, composti antibatterici, enzimi ed ha un pH compreso tra 6,2 e 7,4 (Chen, 2009). La saliva, mediante l’azione di idratazione/diluizione dell’alimento, può influenzare la ripartizione dei composti volatili nel cavo orale (van Ruth e Roozen, 2000) specialmente in matrici grasse. In alimenti o bevande a basso pH, la neutralità della saliva può spostare l’equilibrio relativo tra le molecole odorose (Roberts e Acree, 1995), mentre i sali presenti possono causare un effetto salting-out aumentando la concentrazione delle molecole volatili nella fase gassosa rispetto a quella liquida (Friel e Taylor, 2001).

Oltre ai sali, la saliva è composta prevalentemente da proteine e glicoproteine che vengono sintetizzate, immagazzinate e secrete dalle cellule dei segmenti terminali. Fra questi vi sono:

• amilasi (ptialina), con la funzione di idrolizzare l’amido degli alimenti
• e mucina, una glicoproteina secreta dalle ghiandole sottolinguali, responsabile della viscosità della saliva.

Amilasi e glicoproteine costituiscono la gran parte della secrezione organica dei segmenti terminali. Oltre all’amilasi salivare la saliva umana contiene altri numerosi enzimi che possono essere secreti dalle ghiandole salivari, quali la lipasi salivare, esterasi e ossidasi.

La saliva contiene anche una certa quota di albumina, immunoglobulina, tiocianato ed altre sostanze ad azione batteriostatica o addirittura battericida, tali da contrastare la proliferazione batterica, come le perossidasi e il lisozima (Chen, 2009). È stato dimostrato che le proteine della saliva possono stabilire delle forti interazioni con i composti volatili, influenzando in maniera più o meno marcata il loro rilascio (o la ritenzione). Alcuni studi effettuati da Pagès et al. (2014) hanno dimostrato che grandi concentrazioni di α-amilasi possono portare a un minor rilascio di aroma, soprattutto di esteri e chetoni. Invece, la mucina contiene molti domini idrofobici e complessivamente presenta una carica negativa, a causa della presenza di alcuni gruppi solfato. Essa influenza il rilascio di aroma di aldeidi e chetoni, probabilmente mediante legami di natura idrofobica anche se non vengono esclusi anche altri tipi di legami non-covalenti. Altri enzimi come le esterasi possono, invece, incidere sul rilascio degli esteri.

In uno studio, che ha simulato le condizioni della bocca mediante l’impiego di un sistema R.A.S. (Retronasal Aroma Simulator, simulatore dell’aroma percepito per via retronasale), è stato verificato che la saliva aumenta il rilascio di esanale e di trans-2-pentenale dall’olio (grafico 3) (Genovese et al., 2015). In un altro studio in vitro, mediante l’analisi APCI-MS, l’etil acetato, 1-penten-3-one e linalolo hanno mostrato un effetto salting-out iniziale (ossia un aumento della loro concentrazione nella fase gassosa rispetto a quella di partenza), che può essere spiegato dal passaggio delle molecole da un sistema bifase: fase lipidica (olio di oliva) e fase gassosa (spazio di testa), ad un sistema “trifase”: fase lipidica, fase acquosa (saliva umana) e fase gassosa che si viene a creare in bocca (Genovese et al., 2017).

Dopo la fase iniziale, si è verificato una successiva riduzione a carico degli esteri (acetato di cis-3-esenile, butanoato di etile), aldeidi (trans-2-esenale, esanale) e 1-penten-3-one, probabilmente dovuta all’azione diretta dei costituenti della saliva come mucina, α-amilasi ed esterasi nei confronti di tali composti volatili (Ployon et al., 2017).

Effetto dei biofenoli sul rilascio di aroma

Le sostanze fenoliche possono interagire sia con le proteine della saliva che con i composti volatili della matrice alimentare, modificando il rilascio dell’aroma, grazie alla formazione di legami idrogeno, di interazioni idrofobiche o idrofiliche, oppure, meno frequentemente, di legami covalenti. Un recente studio condotto su di un sistema modello, che simulava l’aroma retronasale, ha evidenziato che in un olio con un livello medio-basso di polifenoli (circa 300 mg/kg) c’è una concentrazione più bassa di molecole aromatiche rilasciate all’interno della cavità orale rispetto a un olio privo di fenoli (grafico 4) (Genovese et al., 2015). La spiegazione di questo fenomeno può essere ricondotta alle reazioni che avvengono tra composti fenolici e proteine della saliva nei confronti dei composti aromatici, che vengono così rilasciati in minore concentrazione nello spazio di testa della bocca.

In un altro studio sono stati monitorati otto composti volatili in condizioni dinamiche, sia in vitro che in vivo, in un olio di oliva rettificato con e senza l’aggiunta dei composti fenolici (593 mg/kg) estratti in precedenza da un Oevo (Genovese et al., 2017). Nello studio in vitro è emerso che i composti fenolici possono interagire con molecole come esanale, linalolo e 1-esanolo, probabilmente con legami non covalenti ma reversibili. Lo studio in vivo ha dimostrato che, dopo la deglutizione, in presenza di fenoli, il rilascio di 1-penten-3-one, trans-2-esenale, cis-3-esenil acetato e butanoato di etile è inferiore rispetto a quello determinato per il campione di olio privo di fenoli (grafico 5) confermando anche i risultati ottenuti in precedenza (Genove- se et al., 2015). Al contrario, il linalolo e l’1-esanolo hanno mostrato un effetto salting-out, probabilmente dovuto all’interazione che avviene tra i composti fenolici e la mucina. Questa interazione potrebbe attenuare l’attività della proteina nei confronti dei composti volatili e di conseguenza determinarne un maggior rilascio nella cavità orale.

I composti fenolici sono responsabili anche di una maggiore persistenza aromatica in bocca soprattutto per i composti idrofobi come linalolo e cis-3-esenil acetato. Questo potrebbe spiegare la maggiore persistenza di alcuni odori che spesso è percepita durante l’assaggio di un Oevo ricco di biofenoli.

Dal punto di vista sensoriale è emerso anche che una concentrazione di polifenoli pari a 511 mg/kg (Oevo molto amaro) è responsabile della ridotta percezione dell’attributo fruttato di circa il 55% rispetto ad un olio con una minore concentrazione di polifenoli, pari a 298 mg/ kg (Oevo leggermente amaro). L’attenuazione delle note fruttate, nell’olio molto amaro, porta anche ad una maggiore riconoscibilità dei difetti di rancido ed avvinato. Al contrario, il difetto di riscaldo viene percepito meno (-33%) in un olio con più biofenoli (grafico 6).

Questi risultati evidenziano che il rilascio di aroma retronasale di un Oevo non dipende solo dalla concentrazione delle sostanze volatili, ma anche dal livello di biofenoli. Ciò porta ad una maggiore intensità odorosa percepita durante l’assaggio di un Oevo ricco di biofenoli, dei composti volatili idrofobi rispetto a quelli idrofili e ad una diversa percezione del flavour e degli off-flavour.

In conclusione

In conclusione, l’accurata misura strumentale delle molecole di impatto odoroso, associata a quella dei biofenoli, potrà contribuire a definire in modo sempre più preciso la qualità e l'identità sensoriale di un olio extra vergine di oliva, anche in situazioni limite in cui la valutazione sensoriale può essere poco riproducibile a causa di effetti di mascheramento, sinergia e/o antagonismo tra molecole fenoliche e volatili e tra molecole volatili responsabili del flavour e degli off-flavour.

Ulteriori ricerche sono attualmente in corso nell’ambito del “Progetto Ager-2 (grant n. 2016-0174) COMPETITIVE (Claims of Olive oil to iMProvE The mar- ket ValuE of the product)”.

La bibliografia completa è disponibile su richiesta.